近年來伴隨著精準醫學的發展，個性化新療法，特別是基因治療已成為其中發展潛力的治療方向之一。

基因治療（Gene Therapy）是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償缺陷和異常基因，從而達到疾病治療的目的。按照使用的核酸不同，又可以分為基于DNA和基于RNA兩大類。基于DNA的主要有CAR-T細胞和CRISPR基因編輯的離體基因治療，體內基因編輯(CRISPR等)和遞送基因片段（質粒、病毒等載體）的在體基因治療。基于RNA的主要有反義寡核苷酸（ASO）、RNA干擾（siRNA、miRNA）、基因激活（saRNA）、mRNA和RNA編輯（CRISPR）。

本期#封面故事專題我們主要會聚焦分子量較大的基于DNA治療和mRNA治療過程中的色譜技術方案。

mRNA的質量控制

由于mRNA療法會受到大量RNA酶的降解，從而使mRNA的穩定性受到影響。為了改善mRNA的效率和穩定性，阻止5'核酸酶降解mRNA，現在已經創建了各種帽分子來維持珍貴mRNA序列的生物學穩定性。5'帽的多樣性和完整性的分析表征對于分子穩定性和給藥安全至關重要。poly A尾是腺苷的重復序列（A），在3'端，該尾巴長度的增加為“核心"序列提供了額外的穩定性，該序列可保證細胞核中mRNA的穩定和細胞質中mRNA的降解，調配mRNA與核糖核蛋白的結合以及隨后的宿主免疫反應。鑒于mRNA穩定性的挑戰以及當前遞送方式的挑戰，了解poly A尾降解的情況是改善治療的重要方式。基于BioZen 2.6µm Oligo（詳見P202~203）色譜柱，我們以HPLC方法匹配高分辨率質譜法（HRMS），以區分多種帽子及其相對完整性以及Poly A尾的長度解析。

AAV載體的質控分析

使用腺相關病毒(AAV)作為基因治療中ssDNA遞送的有效載體是主流的一種方式。迄今為止，大約有13種不同的血清型被鑒定出具有一系列共同的氨基酸序列。在結構上，病毒衣殼是由三個衣殼或病毒蛋白(VP)以1:1:10(VP1:VP2:VP3)的比例以非共價組裝而成的三角形蛋白質二十面體。考慮到血清型和結構蛋白序列之間的相似性，蛋白質鑒定、相對蛋白比例和翻譯后修飾評估是至關重要的。我們使用Biozen Intact XB-C8（詳見P212~213）反相色譜柱，通過LC-MS分析AAV5和AAV9中變性和解離的衣殼蛋白。

與任何蛋白質一樣，病毒蛋白(vp)也會受到翻譯后修飾的影響，從而影響穩定性、衣殼組裝和整體功效。因此，肽圖譜可用于評估這些修飾的存在和鑒定。Biozen Peptide XB-C18（詳見P204）色譜柱具有良好的峰容量和高水平的序列覆蓋分離。

LNP原料的質控

脂質納米粒（LNP）是由可電離脂質制成的球形囊泡，在低pH值下帶正電（使RNA絡合）和生理pH值下中性（與帶正電荷的脂質體相比，減少潛在的毒性作用）。由于其大小和性質，脂質納米粒可以通過內吞作用被細胞吸收，并且脂質在低pH下的電離性可使內體逃逸，這允許遞送物釋放到細胞質中。此外，脂質納米粒通常含有促進細胞結合的輔助脂質，比如填充脂質之間間隙的膽固醇，以及減少血清蛋白調理作用和網狀內皮清除的聚乙二醇（PEG）。因此LNP通常有四種成分：輔助脂質、陽離子或可電離脂質，膽固醇和聚乙二醇化脂質。LNP原料的組成對于LNP的形成以及功能具有非常重要的作用。Luna（詳見P266~P290）和Kinetex（詳見P236~264）色譜柱組合通常會用于LNP原料分析，從而把控好遞送的第一關。

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